PENDAHULUAN
Sel merupakan unit struktural fungsional terkecil dari kehidupan. Sel dibentuk atas
berbagai kompartemen. Organ tubuh manusia terbentuk dari sel dan matriks interselular.
Untuk mengamati sel dan jaringan tubuh yang berukuran kecil diperlukan mikroskop dan
pengetahuan pemrosesan jaringan dan istilah-istilah dalam pengamatan mikroskopis sel.
TEKNIK MEMPELAJARI SEL
Sejak ditemukannya mikroskop, perhatian dan minat para ahli biologi untuk
mempelajari sel semakin berkembang. Selain menggunakan mikroskop, peran sel dapat
dipelajari melalui berbagai teknik biokimia dan kultur sel.
Teknik Biokimia
Teknik biokimia dilaksanakan dalam tiga cara utama yaitu
memecah/merusak/mencerai beraikan jaringan/sel menjadi bagian-bagian kecil / fraksi sel
(homogenat), purifikasi/separasi komponen-komponen sel, dan menganalisis komponen /
fraksi sel berdasarkan sifat-sifat fisik dan atau biokimia.
Teknik Kultur Sel
Sel (hewan, tumbuhan, bakteri) dapat hidup bebas apabila diberi kondisi tertentu
sesuai dengan kebutuhan hidup sel. Teknik ini digunakan pada percobaan-percobaan yang
melibatkan sel sebagai subjek maupun objek penelitian. Sel dapat menunjukkan tanda-tanda
hidup dan dapat mengekspresikan karakter sel sesuai dengan tingkat diferensiasinya.
Sel ditumbuhkan di dalam media kultur. Media kultur berisi bahan-bahan untuk
pertumbuhan sel seperti nutrien, growth factors, sumber ion, antibiotik, prekursor biosintesis,
metabolit, stimulan dan vitamin. Di dalam media kultur, sel mampu berproliferasi
membentuk selapis sel (mono layer) pada dasar/dinding tabung.
Mikroskop
Resolving Power adalah kemampuan suatu alat optik untuk membedakan 2 titik yang
terpisah pada jarak yang paling dekat. Mata manusia memiliki resolving power sejauh 100
μm. Sementara diameter sel hewan/manusia ialah 10-20 μm. Dengan demikian, untuk
mengamati sel, manusia memerlukan alat bantu yang berupa mikroskop. Mikroskop cahaya
(compound microscope) yang sederhana memiliki resolving power sejauh 0,2-0,8 μm.
Resolving power mikroskop cahaya sebanding dengan panjang sinar yang dipakai. Dengan
menggunakan mikroskop cahaya, manusia mampu mengamati bakteri dan mitokondria.
Mikroskop elektron memiliki resolving power sejauh 2-4 nm. Alat ini dapat digunakan untuk
melihat partikel dan organel sel yang lebih kecil.
Hasil diferensiasi suatu mikroskop sehingga diperoleh gambar atau bayangan yang
baik/nyata disebut resolusi. Resolusi mikroskop dipengaruhi oleh panjang gelombang ( ),
indeks refraksi (n), dan aperture. Nilai indek refraksi bergantung pada media yang dilalui
sinar antara obyektif dan spesimen. Indek refraksi dapat diperbesar nilainya dengan memberi
minyak emersi atau air. Aperture adalah ½ sudut sinar datang/dikoleksi lensa obyektif.
Selain mikroskop cahaya kovensional, beberapa modifikasi mikroskop cahaya adalah:
1. Mikroskop Flouresensi
Mikroskop fluoresensi digunakan untuk melihat molekul/struktur spesifik dalam sel.
Molekul menyerap cahaya berenergi tinggi ( pendek, ultraviolet) dan memancarkannya
kembali pada energi yang lebih rendah ( panjang = visible light). Molekul/bagian sel yang
akan diamati dikonjugasi dengan zat flourescen. Zat fluoresen bisa berrupa zat quinacrine
(untuk demonstrasi kromosom Y) atau antibodi yang dikonjugasi dengan zat fluoresen.
Mikroskop flouresensi biasanya dilengkapi 2 filter. Filter pertama akan menyeleksi
cahaya yang datang menuju spesimen (dengan panjang gelombang 200 -300 nm). Filter ini
hanya mengambil sinar yang mengeksitasi flouresen pada spesimen. Filter kedua akan
menyeleksi cahaya yang meninggalkan spesimen. Dengan kata lain, filter kedua akan
melewatkan sinar dengan panjang gelombang yang sesuai dengan zat flouresen yang dipakai.
2. Mikroskop Fase Kontras
Mikroskop fase kontras digunakan untuk melihat sel dalam keadaan utuh/hidup. Bila
sinar melewati sel/bagian sel, cahaya tersebut akan berubah fase sesuai dengan indeks
refraksi sel. Cahaya yang melewati bagian padat sel (misalnya nukleus) akan mengalami
perubahan fase secara relatif dibandingkan dengan bagian sekitarnya. Perubahan fase akan
diinterferensikan oleh ring phase. Cahaya satu fase akan mengalami interferensi sehingga
saling memperkuat dan menimbulkan warna terang. Cahaya yang berbeda fase akan
mengalami interferensi juga namun dalam keadaan saling melemahkan sehingga cahaya yang
dihasilkan redup.
3. Mikroskop Lapangan Gelap
Cahaya yang melewati obyek (sel) akan berpendar (scattered). Mikroskop ini
dilengkapi alat yang dapat mengarahkan sinar yang berpendar ke lensa obyektif. Sel kelihatan
teriluminasi dengan latar belakang yang gelap.
Histoteknik
Hampir semua jaringan tubuh manusia tidak memiliki warna. Agar dapat mengamati
strukturnya, sel dan jaringan harus diwarnai terlebih dahulu. Zat warna (dyes) terdiri atas
banyak jenis. Sebelum dapat diwarnai, jaringan-jaringan organ yang akan diamati akan
menjalani serangkaian proses yang disebut tissue processing. Pemrosesan jaringan ini akan
mengawetkan, mencegah pembusukan, dan memudahkan pewarnaan jaringan dan sel karena
mereka memiliki sifat alamiah untuk mengikat zat warna. Pekerjaan membuat jaringan
hingga siap untuk diamati disebut sebagai histoteknik.
Jenis proses pembuatan preparat/sediaan histologi dapat dikelompokkan sebagai
berikut:
1. Preparat rutin
Yang dimaksud dengan preparat rutin ialah preparat jaringan yang diproses secara
sederhana dan diwarnai dengan pewarnaan hematoxylin – eosin (HE). Pembuatan preparat
jenis ini sangat sering dilakukan di laboratorium histology/mikroteknik sehingga dapat
dikatakan dikerjakan secara rutin. Preparat jenis ini biasa digunakan dalam proses pendidikan
karena sebagian besar struktur mikroskopis sudah dapat didemonstrasikan dengan teknik ini.
2. Preparat khusus
Preparat khusus ialah preparat yang dibuat dengan teknik tertentu dan lebih sulit
dalam pengerjaannya. Pengerjaannya dilakukan sewaktu-waktu dikarenakan faktor kesulitan
dan penggunaan bahan-bahan yang lebih mahal. Preparat khusus dapat berupa preparat
dengan pewarnaan khusus (misal: pewarnaan perak, pewarnaan lemak, pewarnaan neuroglia),
imunohistokimia, in situ hybrization, dan preparat untuk mikroskopi elektron. Hal mengenai
preparat khusus tidak dibicarakan dalam bahan ajar ini.
Tahapan Dalam Pembuatan Preparat Rutin
Sedikitnya terdapat 10 langkah dalam tahapan pembuatan preparat rutin yaitu
pengawetan, dehidrasi (pengeluaran air dari dalam sel/organ), pembeningan (clearing),
pembenaman (embedding), pencetakan (blocking), pengirisan blok jaringan (sectioning),
penempelan irisan pada kaca objek, pewarnaan (staining), penutupan preparat dengan kaca
penutup (mounting), dan pelabelan preparat (labeling).
Pengawetan (fixation) dilakukan untuk mempertahankan struktur sel dan jaringan
sedapat mungkin mendekati keadaan aslinya (saat masih hidup). Sebagian besar dari larutan
pengawet bekerja untuk mempertahankan protein. Dengan demikian, tidak ada satu pun jenis
larutan pengawet yang dapat melakukan pengawetan secara sempurna dalam mencapai tujuan
pengawetan.
Karena sebagian besar volume sel terdiri dari air dan air memberikan konsistensi
lunak pada jaringan sehingga keberadaan air dalam sel akan menyulitkan pengirisan jaringan.
Untuk itu, air dalam jaringan / sel mesti dikeluarkan dari sel dengan menggunakan dehidran
seperti alkohol atau aseton. Selain menarik air dari dalam jaringan dan sel, penggunaanalkohol akan mengakibatkan larutnya komponen lemak dari sel. Contoh yang paling nyata
dapat ditemukan pada jaringan lemak (adiposa) yang diproses dengan cara ini, saat jaringan
telah diwarnai, kita akan mendapati vakuola lemak kosong di dalam sel preparat jaringan
adiposa putih .
White adipose tissue. Pada preparat, semua lemak telah dihilangkan dan sel-sel lemak
tampak sebagai lingkaran kosong dengan nukleus yang terletak di pinggir (a). Gambar 1b
menunjukkan jaringan adiposa dalam preparat mesenterium yang dilekatkan secara langsung (whole
mount) menggunakan pewarna Sudan yang larut lemak. Lemak terwarnai merah. Fibroblast dan
nuklei lainnya dapat di lihat juga di sebelah kanan.
Untuk dapat diiris dengan mikrotom (Gambar 2), jaringan harus menjadi cukup keras.
Secara rutin, parafin digunakan mengisi bagian sel yang telah ditinggalkan oleh air. Namun,
parafin tidak dapat menyusup ke dalam sel tanpa bantuan zat yang disebut sebagai bahan
penjernih (clearing agent). Bahan penjernih yang rutin digunakan adalah xylol. Setelah
mencapai tahap jernih, jaringan akan direndam dalam parafin cair bersuhu 55 oC selama 3
jam di dalam inkubator. Diperkirakan selama waktu tersebut, parafin yang dapat bercampur
dengan xylol akan menggantikan xylol di dalam jaringan.
Langkah selanjutnya adalah melakukan pencetakan dengan cetakan parafin. Sampel
organ dikeluarkan dari inkubator dan diberi tambahan parafin cair. Saat parafin mengeras,
kita telah mendapatkan blok parafin berisi sampel organ yang kita inginkan.
Pengirisan sampel dilakukan dengan menggunakan mikrotom dengan ketebalan yang
diinginkan. Variasi ketebalan disesuaikan dengan tujuan pembuatan preparat. Untuk
penggunaan rutin, ketebalan yang sesuai adalah 5 μm.
Setelah dilekatkan pada kaca benda (object glass), irisan dapat diwarnai dengan
pewarnaan yang diinginkan. Makna yang diinginkan berarti mengikut kepada unsur yang
akan didemonstrasikan. Unsur tersebut dapat berupa suatu protein, karbohidrat, atau
gambaran umum struktur histologis. Untuk pilihan terakhir, pewarnaan yang digunakan
adalah hematoxylin eosin.Pewarnaan yang rutin digunakan di laboratorium histopatologi di seluruh dunia adalah pewarnaan HE Larutan pewarna hematoxylin mengandung beberapa zat
lainnya selain daripada zat warna hematoxylin, dikenal sebagai zat mordan. Larutan eosin
dibuat dengan melarutkan zat warna eosin dalam akuades dan alkohol.
HE merupakan teknik pewarnaan yang berdasarkan pada prinsip asam basa. Larutan
hematoxylin bersifat basa sedangkan larutan eosin bersifat asam. Sifat basa pada larutan
hematoxylin akan memungkinkan hematoxylin berikatan terutama dengan komponen sel
yang bersifat asam. Hematoxylin sendiri bukanlah zat warna yang benar-benar bersifat basa.
Kita dapat mengamati bahwa warna biru yang ditimbulkan hematoxylin akan banyak
ditemukan pada nukleus. Hal ini terjadi karena nukleus mengandung DNA dan RNA, suatu
zat yang bersifat asam. Sementara itu, eosin akan mengikat komponen sel yang bersifat asam.
Kita dapat menemukan cukup banyak komponen sel yang bersifat asam, meski tidak
semuanya, pada sitoplasma sel.
ISTILAH DALAM PENGAMATAN PREPARAT HISTOLOGI
Istilah dasar dalam pengamatan histologi didasarkan pada sifat dan karakter
pewarnaan (asidofilik, basofilik, dan sebagainya), bentuk (cuboidal, columnar, spindel,
squamous, reticular), kemiripan dengan bentuk lain (star-shaped appearance, umbrella sign,ladder like, signet ring cell), posisi sesuatu terhadap polaritas sel (apical, basal, centric,
eccentric, adluminal, peri nuclear).Beberapa istilah pewarnaan yang didasarkan pada sifat dan karakter pewarnaan adalah
perlu dipahami.
Asidofilik
Asidofilik menjabarkan pola pewarnaan sel jaringan tertentu yang menggunakan
pewarnaan asam dan basa (misalnya HE). Secara khusus, asidofilik merujuk pada sifat
struktur yang senang berikatan dengan zat warna asam. Pada pewarnaan yang menggunakan
eosin, suatu zat warna yang bersifat asam, makna asidofilik dapat disamakan dengan
eosinofilik. Bagian sel yang sering menunjukkan sifat asidofilik adalah sitoplasma sel. Zat
warna asam lainnya adalah biru anilin, acid fuchsin, dan orang G.
Basofilik
Basofilik merujuk pada sifat struktur yang senang berikatan dengan zat warna basa.
Zat warna basa yang sering digunakan adalah hematoxylin. Selain hematoxylin, zat warna
basa lainnya adalah biru toluidin. Bagian sel yang menunjukkan sifat basofilik adalah
nukleus.Argirofilik / Argentaffin
Perak (argentum) digunakan terutama untuk mendemonstrasikan protein (khususnya
serabut retikular (kolagen tipe III)) dan DNAChromaffin
Chromaffin merujuk pada keadaan yang dapat didemonstrasikan oleh pewarnaan
garam chromium. Garam chromaffin mengoksidasi dan mempolimerisasi katekolamin untuk
membentuk warna coklat, yang terkuat warnanya dihasilkan oleh sel yang menyekresikan
noradrenalin.
Metakromasia
Metakromasia adalah perubahan khas pada warna dari pewarnaan yang terjadi pada
jaringan biologis, ditunjukkan oleh zat warna anilin tertentu saat zat warna tersebut berikatan
dengan bahan-bahan tertentu yang terdapat pada jaringan biologis, yang disebut
chromotrophes. Sebagai contoh biru toluidin menjadi merah muda (pink), tidak mewarnai
jaringan menjadi biru, saat berikatan dengan cartilage. Ketiadaan perubahan warna pada
pewarnaan dinamai ortokromasi.Periodic Acid Schiff (PAS)
Reaksi terhadap pewarnaan PAS menunjukkan adanya glikogen dalam jaringan.
Periodic acid akan mengoksidasi residu glukosa dan menghasilkan aldehida yang selanjutnya
bereaksi dengan reagen Schiff dan menimbulkan warna magenta-purple. Pewarnaan PAS
diberi perona (counterstain) berupa pewarnaan basa (mislnya hematoxylin). Pewarnaan PAS
akan menunjukkan keberadaan karbohidrat pada jaringan ikat, mukus, dan membran basal
jaringan epitel.
Sudanofil
Pewarnaan Sudan adalah penggunaan zat warna untuk mewarnai bahan-bahan
sudanofil, biasanya lemak. Pewarnaan sudan digunakan untuk mendemonstrasikan
trigliserida, lipid, dan lipoprotein.
Sumber: dr.Zulham, M. Biomed FK USU histo_fkusu@yahoo.com
